Что могут и чего не могут рассказать гели и блоты — как интерпретировать (без излишней интерпрета...

Что можно и чего нельзя определить, просто взглянув на гель? А как насчет блота? Что он может показать, а что нет? (Ссылка на статью в блоге: https://bit.ly/gel_vs_blot) Простой гель для анализа белков, ДНК или РНК не может определить идентичность присутствующих молекул. Он не может дать однозначного ответа (как вы увидите, когда я подробно расскажу о перекрывающихся полосах и тому подобном). Но он может дать приблизительное представление о количестве и степени присутствия различных молекул. Если вы очищаете или работаете с очищенным белком и уверены, что большая толстая полоса — это интересующий вас белок, вы можете оценить его чистоту — сколько других полос присутствует? И какая доля общего сигнала приходится на полосу, соответствующую интересующему вас белку? Он также может рассказать о целостности этой молекулы — видите ли вы множество более мелких полос или размытое пятно под ними? Это может указывать на деградацию — возможно, вам потребуется добавить ингибиторы протеаз или нуклеаз, или, по крайней мере, обработать образцы более тщательной тонкослойной хроматографией (и льдом, избегая циклов замораживания-оттаивания и т. д.). Это может рассказать вам об относительных размерах различных присутствующих молекул — вы можете сравнить их с «лестницей» (маркерами молекулярной массы), которую вы используете параллельно. Но имейте в виду, что молекулярная масса вашего белка может быть немного выше или ниже, чем вы ожидаете, исходя из его расчетной молекулярной массы. Также, если вы видите размытую полосу, это может указывать на то, что часть молекул модифицирована (например, белки фосфорилированы). Но если это происходит с несколькими полосами, это также может означать, что вы проводили электрофорез слишком быстро, слишком долго держали образец или загрузили слишком много образца. Интенсивность полосы связана с количеством образца, но это сложный вопрос. Поскольку у меньших молекул меньше мест для связывания красителя, вам потребуется больше их копий, чтобы получить ту же интенсивность, что и у более крупной молекулы. Кроме того, и это особенно важно для белков, состав белка может влиять на то, насколько хорошо краситель связывается с ним (поскольку эти красители обычно предпочитают связываться с определенными аминокислотами, а разные белки имеют разные комбинации аминокислот, два белка одинакового размера и количества могут иметь полосы разной интенсивности). Кстати, о наличии нескольких молекул одинакового размера: если у вас есть несколько веществ, близких по размеру, их полосы будут перекрываться, поэтому вы можете думать, что у вас одна полоса, но на самом деле их несколько. Это одна из причин, почему следует выбирать процентное содержание геля таким образом, чтобы обеспечить наилучшую «разрешающую способность» в диапазоне интересующей вас молекулы. Вы можете (часто достаточно точно) предсказать, что полоса соответствует определенной молекуле, основываясь на ее относительном размере и на том, что вы ожидаете увидеть на ней (особенно в системах in vitro, работающих с очищенными или частично очищенными молекулами). Но для подтверждения идентичности вам придется провести что-то вроде блоттинга, масс-спектрометрии, секвенирования или чего-то подобного. В блоттинге используются специфические зонды (антитела к белкам в вестерн-блоттинге и меченая ДНК для ДНК в саузерн-блоттинге или РНК в ноузерн-блоттинге) для поиска специфических молекул после переноса молекул из геля на мембрану. Однако блоттинг тоже не идеален. Он наиболее полезен для сравнения относительного количества подтвержденной молекулы в разных образцах. Разные антитела различаются по силе. Поэтому, если у вас очень сильное антитело, вы можете увидеть более интенсивную полосу для белка, присутствующего в меньшем количестве, чем полосу для белка, которого много, но антитела слабые. Но если вы сравниваете один и тот же белок, одно и то же антитело, но разные образцы, более интенсивная полоса указывает на большее его количество (при сравнении образцов убедитесь, что вы загружаете одинаковое общее количество образца). Антитела (в случае белков) и меченые олигонуклеотидные зонды (для ДНК и РНК) также различаются по своей специфичности. В идеале они должны связываться только с тем, с чем вы хотите их связать. К сожалению, они часто также связываются «неспецифически» с другими веществами. Поэтому, по возможности, используйте отрицательный контроль, в котором, как вы знаете, отсутствует искомый компонент (но присутствует всё остальное), и положительный контроль очищенного компонента, который вы ищете, чтобы знать, где должна находиться истинная полоса. Блоттинг ничего не говорит о чистоте. Поэтому часто для этого также показывают результаты окрашивания всех белков или нуклеиновых кислот. Это можно сделать отдельно (например, провести два одинаковых геля) или, что ещё лучше, с помощью обратимого красителя на мембране (например, красителя Понсо для белков). Краткое изложение и ссылки на дополнительную информацию в комментариях.